ほしいDNA配列を増やす:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

polymerase-chain-reaction 生化学ノート

別記事で名前だけ出ていたPCR(Polymerase chain reaction)についてです。

↓先日の記事はこちらになります。

大腸菌の力を借りてほしいDNA配列を手に入れる:遺伝子組換え
組換DNA技術というのが確立し、特定DNAを単離、増量、改変することを可能にしました。つまり、菌体内にほしい配列を持ったDNAがたくさんある状態を作ることができます。今回はこの遺伝子組換えによってほしいDNAを手に入れる手順について、見ていきましょう。

自分がほしいDNAの配列を「増やす」技術となります。
宿主に発現させるDNAを作るためには必要不可欠な技術です。
かなり確立された方法なので、実験は高度にルーティン化されています。

キットも豊富で、増やすための酵素も失敗しにくいように改良されています。
あとは、試薬を指定通りチューブに加え、機械にセットして待つだけ、でだいたいできてしまいます。

私は学部時代の化学実験でも行ったが、実験は難なくできましたが、レポートでプライマーの設計法などで苦しんだ記憶があります。

ということで、ここでまとめていきたいと思います。

PCR実験の概要

原理的には絵にしてみると単純なので、絵を使って見ていきましょう。

テンプレートとなるDNAを1本鎖に分けて、それぞれを鋳型にして相補鎖を合成します。
これを1サイクルとして、何サイクルも繰り返すと、指数関数的にDNAを増やすことができます。

DNAを1本鎖に分けるために、温度を90 °C以上に上げます。
90 °C以上まで上げてしまうと、通常のDNAポリメラーゼでは失活してしまいます。

しかし、高温環境下で生きる高度好熱菌から取れるTaqポリメラーゼという熱安定性の高い酵素を用いることで、この問題を解決することができました。

次に、プライマーと塩基対を形成させるために、温度を下げます。その温度はプライマーの配列に依存します。
それを足がかりにDNAポリメラーゼがdNTPをどんどんつなげていきます。

2本鎖が合成されると、またそれが次のサイクルでのテンプレートDNAとなります。
したがって、実験としては、反応を進めるために温度を連続的に変化させるだけということになります。
そのために使用する機械が「サーマルサイクラー」という装置です。

PCRの鍵:プライマーの配列設計

PCR反応ではチューブの中に以下の試薬が含まれています。

  • テンプレートとなるDNA
  • プライマー(二本)
  • dNTP
  • DNA合成酵素(DNAポリメラーゼ)

プライマー配列の設計方法

反応を成功させる上で、鍵となるのはプライマーの配列です。
PCRを行う目的によっても異なるが、普通はほしい配列を挟み込むように設計します。

図では増やす領域とプライマーがピッタリ重なっていますが

  • 制限酵素が反応しやすいよう数塩基分「のりしろ」をもたせる。
  • 制限酵素の認識配列を入れることで、あとで切り出しができるように設計する

といった工夫をすることがあります。

プライマーの性質

また、プライマー自身の性質として考慮すべき点に「長さ」「配列」「Tm値」をがあります。

長さ

20~35塩基が妥当であろうと思います。
長すぎると鋳型DNAに結合しにくく、短すぎると非特異な会合が多くなります。

配列

プライマーに含まれる塩基の割合、並びを気にした方がいい場合もあります。
GとCの塩基対は結合が強い(水素結合が多い)ため、多すぎるとこれも非特異な結合が多くなります。

配列によってはプライマーが高次構造を持ったりする可能性もあるので、注意する必要があります。

Tm値

Tm値とは2本鎖DNAの50%が1本鎖に解離する温度を表します。
設計した二本のプライマー間でこのTm値に差がありすぎると、プライマーの結合温度の設定が難しくなります。

Tm値はG、Cの割合が多くなると高くなる傾向にあるので、結合と関係ないのりしろ部分の配列をA, Tに変える等、調節する必要があります。

最後に

まとめてみると、かなりあっさりしているようにみえるかもしれません。
しかし、プライマー設計は意外と奥が深く、色々とコツがあります。

PCRは分子生物学の実験だけではなく、色々な場で不可欠な技術となりました。

臨床の場では伝染病の診断、発がんにかかわる遺伝子の変異の検出など
犯罪では現場に残った毛などからPCRでDNAを増幅し、個人を特定するのに利用されています。
意外と身近に用いられている技術です。

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