ほしいDNA配列を増やす:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

核酸

別記事で名前だけ出ていたPCR(Polymerase chain reaction)についてである。

先日の記事はこちら

大腸菌の力を借りてほしいDNA配列を手に入れる:遺伝子組換え
大腸菌を培養し、その中から目的の配列部分のみを取り出すのはかなり大変な作業である。ここで、組換DNA技術というのが確立し、特定DNAを単離、増量、改変することを可能にした。今回はこの遺伝子組換えによってほしいDNAを手に入れる手順について、見ていく。

自分がほしいDNAの配列を「増やす」技術である。
宿主に発現させるDNAを作るためには必要不可欠となる。
かなり確立された方法なので、実験は高度にルーティン化されている。

キットも豊富で、増やすための酵素も失敗しにくいように改良されている。
あとは、試薬を指定通りチューブに加え、機械にセットして待つだけ、でできてしまうことも多い。

私は学部時代の化学実験でも行ったが、実験は難なくできた。
しかし、レポートでプライマーの設計法などで苦しんだ記憶がある。

ということで、ここでまとめてみたい。

PCR実験の概要

原理的には絵にしてみると単純なので、絵を使って見てみる。

テンプレートとなるDNAを1本鎖に分けて、それぞれを鋳型にして相補鎖を合成する。
これを1サイクルとして、何サイクルも繰り返すと、指数関数的にDNAを増やすことができる。

DNAを1本鎖に分ける際、温度を90 °C以上に上げる。
90 °C以上まで上げてしまうと、普通のDNAポリメラーゼは失活する。

しかし、高温環境下に生きる高度好熱菌から取れるTaqポリメラーゼという熱安定性の高い酵素を用いることで、この問題を解決できる。

次に、温度を下げてプライマーと塩基対を形成させる。
それを足がかりにDNAポリメラーゼがdNTPをどんどんつなげていく。

2本鎖が合成されると、またそれが次のサイクルでのテンプレートDNAとなる。
したがって、実験としては、反応を進めるために温度を連続的に変化させるだけである。
そのための機械が「サーマルサイクラー」という装置になる。

PCRの鍵:プライマーの配列設計

PCR反応ではチューブの中に以下の試薬が含まれる。

  • テンプレートとなるDNA
  • プライマー(二本)
  • dNTP
  • DNA合成酵素(DNAポリメラーゼ)

プライマー配列の設計方法

反応を成功させる上で、鍵となるのはプライマーの配列である。
PCRを行う目的によっても異なるが、普通はほしい配列を挟み込むように設計する。

 

図では増やす領域とピッタリになってるが、いくつか工夫をする場合がある。
制限酵素が反応しやすいよう数塩基分「のりしろ」をもたせる。
制限酵素の認識配列を入れることで、あとで切り出しができるように設計する
といったことが考えられる。

プライマーの性質

また、プライマー自身の「長さ」「配列」「Tm値」を気にする必要がある。

長さ

20~35塩基が妥当であろう。
長すぎると鋳型DNAに結合しにくく、短すぎると非特異な会合が多くなる。

配列

プライマーに含まれる塩基の割合、並びを気にした方がいい場合もある。
GとCの塩基対は結合が強い(水素結合が多い)ため、多すぎるとこれも非特異な結合が多くなる。

配列によってはプライマーが高次構造を持ったりする可能性もある。

Tm値

Tm値とは2本鎖DNAの50%が1本鎖に解離する温度のこと。
設計した二本のプライマー間でこのTm値に差がありすぎると、プライマーの結合温度の設定が難しくなる。

その場合は、結合と関係ないのりしろ部分の配列を変える等、調節する必要がある。

最後に

まとめてみると、かなりあっさりしているようにみえるかもしれない。
しかし、プライマー設計は意外と奥が深く、まだコツが色々とある。

PCRは分子生物学の実験だけではなく、色々な場で不可欠な技術となった。

臨床の場では伝染病の診断、発がんにかかわる遺伝子の変異の検出など
犯罪では現場に残った毛などからPCRでDNAを増幅し、個人を特定するのに利用されている。
意外と身近に用いられている技術である。

コメント