大腸菌の力を借りてほしいDNA配列を手に入れる:遺伝子組換え

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ここからはより分子生物学的な内容に入っていく。いわゆる「遺伝子組換え」という技術についてである。以前紹介した核酸の塩基配列決定法とともに、現在の研究には欠かせないものとなっている。

遺伝子組換えの必要性はどこにあるのだろうか?それは、ほしい領域はゲノムDNAに比べて非常に少ないということを考える必要がある。

たとえば、10 Lの培養液を用意し、大腸菌を1010個/mLまで培養しても、DNAは0.1 mg程度しか得られない。その状態からゲノムDNAから目的の配列部分のみを取り出さなければならない。精製過程でもロスが避けられないため、必要量のDNAを得るのはかなり大変な作業となることがわかるだろう。

ここで組換DNA技術というのが確立し、特定DNAを単離、増量、改変することが可能になった。これは、菌体内にほしい配列を持ったDNAがたくさんある状態を作ることができる技術である。今回はこの遺伝子組換えによってほしいDNAを手に入れる手順について、見ていくことにする。

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クローニング法によるDNAの増幅

ここでは、以下の項目に分けて紹介していく。

  1. ほしいDNA断片を得る
  2. ベクターと組み合わせる
  3. 目的DNA断片を含むベクターを大腸菌に形質転換させ、複製
  4. 形質転換された大腸菌の選別
  5. 選別した大腸菌の培養・精製

ほしいDNA断片を得る

まずは元となるDNA配列を手に入れなければ始まらない。主に以下の方法が考えられる。

  • 制限酵素で切り出す

ゲノムDNAもしくはほかのベクターからほしいDNA配列を切り出す。すでに発現系を持っているけれどもプロモーターなどを入れ替えたいときに有効である。ここでいう「切る」とは、ヌクレオチド同士をつないでいるリン酸ジエステル結合を加水分解することを指す。特定の塩基配列を認識してDNAを切断するエンドヌクレアーゼである制限酵素を利用する。

エンドヌクレアーゼ:DNA/RNAの内部の塩基配列を認識し、リン酸ジエステル結合を切断する酵素
⇔エキソヌクレアーゼ:DNA/RNAのからリン酸ジエステル結合を切断し、モノヌクレオチドを生じる酵素

  • ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅

詳しくは以下の記事で解説している。

  • 化学合成で断片をつくる

タンパク質の発現が目的であればPCRが圧倒的に多いだろうと考えるので、このパターンが当てはまるのかがわからないが、ペプチドのような短い配列ならば化学合成も手かもしれない。

ベクターと組み合わせる

通常、ベクターには自身の複製に必要な配列を含んでいる。この配列を持つベクターが大腸菌内にあると、増殖するときにベクターも一緒に複製する。発現用のプラスミドを制限酵素によって切り、上記で切り出した配列とつなぐ酵素であるリガーゼによって組み合わせると、目的の配列を含んだ大腸菌プラスミドを作製することが可能となる。

目的DNA断片を含むベクターを大腸菌に形質転換させ、複製

目的とするプラスミドが完成したら、クローニング用の大腸菌に取り込ませる。この操作を形質転換(トランスフォーメーション)と言う。

似た用語に形質導入(トランスフェクション)があるが、異なる用語であるので注意したい。

とはいっても、ただ大腸菌とプラスミドを混ぜたところで大腸菌は取り込んではくれない。プラスミドを持つというのは大腸菌にとってエネルギーを使うので、なくても増殖に影響がないのなら、保持していない方が優勢となってくる。そのため、形質転換には、まず大腸菌を受け入れる状態にする必要がある。このプラスミドを受け入れやすい状態をコンピテント状態という。

よくやられるのは大腸菌をカルシウムなどで処理すると、細胞壁が弱くなってコンピテント状態となる。市販されているクローニング用の大腸菌はすでにコンピテント状態になって市販されているものも多いので、簡便にクローニングを行うことができる。

コンピテント状態の大腸菌にプラスミドを混合すると、ようやく菌体内にプラスミドが入っていく。とはいえ、形質転換の効率というのはせいぜい0.1%程度だそうだ。よって、形質転換された大腸菌とされていない大腸菌を選別する必要が生じてくる。

形質転換された大腸菌の選別

形質転換された大腸菌のみを選別するためには、ベクターに抗生物質耐性遺伝子をいれておき、寒天培地に抗生物質を添加しておくという方法が用いられる。

寒天培地は培地に寒天を加え、シャーレに流し込んで固めたものであり、寒天培地にはベクターに入っている耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加しておく。この上で大腸菌が育つと、塊(コロニー)を形成する。

ところが、寒天培地に抗生物質を撒いておくとベクターを持たない大腸菌は抗生物質によって死滅する。しかし、ベクターを持つ大腸菌は耐性遺伝子を持っているため、ぞうしょくすることができる。よって、この寒天培地上でコロニーを形成した大腸菌は形質転換されたものであると判断することができる。

ここで、注意しなければならないのが「サテライトコロニー」の存在だ。培養してから時間が経ってしまうと、抗生物質の効果が薄れてくる。そうするとプラスミドを持たない大腸菌でも生き延びる事ができてしまう。これがサテライトコロニーである。できたコロニーがサテライトコロニーかどうかは肉眼で判別できないので、プラスミド精製してみて初めてDNAの有無がわかる。なかった場合、当たるまでコロニーを培養するか、もう一度形質転換を行うかまで戻らねばならない。特にアンピシリンを抗生物質として用いる場合に起きやすいので注意が必要である。

選別した大腸菌の培養・精製

コロニーを抗生物質入りの液体培地で培養して増殖させる。抗生物質のおかげで、ベクターを持った大腸菌のみが増殖することができる。抗生物質を入れ忘れるのはやりがちなので、ルーティン実験でも気を抜かないように注意である。失敗しないだろうと思いがちなので、やっちゃうとダメージでかい。

ある程度増殖したら、大腸菌を集めて破砕・精製を行えば、無事DNAを獲得することができる。破砕・精製に関しては別の記事でまとめてみたい。

最後に

今回はほしいDNAを得るまでの流れを簡単にまとめた。こうして書くと遺伝子組換えは簡単な技術に見えるが、やはりそこは生物(なまもの)である。それぞれのステップには実験を成功させるために、気をつけるべきポイントがある。原理を理解し、実験操作の意味を理解することが重要である。

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公開日:2017年11月1日