大腸菌の力を借りてほしいDNA配列を手に入れる:遺伝子組換え

ここからはより分子生物学的な内容に入っていく。
いわゆる「遺伝子組換え」という技術である。
前回の核酸の塩基配列決定法とともに、現在の研究に欠かせないものとなっている。

目の前のDNA溶液はどんな配列?:ジデオキシ法による配列決定
塩基にはACGTUがあるが、もし現実的に目の前にDNA溶液があったとする。どうやってその配列(並び方)を知ることができたのだろうか?当然肉眼では見えないので、色々と工夫をする必要がある。今回は塩基配列決定法の元となったジデオキシ法について解説する。

大腸菌の染色体DNAから1000塩基対を取り出したいと考えたとする。
10 Lの培養液を用意し、大腸菌を1010個/mLまで培養したとしても、DNAは0.1 mg程度である。
大腸菌を培養しても、目的の配列部分のみを取り出す必要がある・・・

精製過程でロスすることを考えると、かなり大変な作業である。

ここで、組換DNA技術というのが確立し、特定DNAを単離、増量、改変することを可能にした。
つまり、菌体内にほしい配列を持ったDNAがたくさんある状態を作ることができる。

今回はこの遺伝子組換えによってほしいDNAを手に入れる手順について、見ていく。

基本用語確認

本題に入る前に、ここではいくつか用語が出てくるため、下に挙げる。

クローニング:単一の祖先に由来する同一な生き物を多く作り出すこと

プラスミド:細菌や酵母が持つ環状DNA分子。染色体とは別に持てるので遺伝物質としても機能

ベクター:複製などに必要な配列を含み、遺伝情報を他に伝える分子

形質転換(トランスフォーム):DNAを外部から宿主に組み込むこと

寒天培地:培地を寒天で固めたもの。形質転換した大腸菌の選別に用いる。

コロニー:寒天培地上の大腸菌の集団

クローニング法によるDNAの増幅

ほしいDNA断片を得る

元となるDNA配列を手に入れる。

→タンパク質を発現が目的であればPCRが圧倒的に多いだろう。短い配列であれば化学合成も手である。

ベクターと組み合わせる

ベクターには複製に必要な配列を含む。
これが大腸菌内にあると、増殖するときにベクターも一緒に複製してくれる。

目的DNA断片を含むベクターを大腸菌に形質転換させ、複製

通常、形質転換の効率はせいぜい0.1%程度と言われている。
この操作は寒天を含んだ培地をシャーレに流し込み固めたものを用いる。

形質転換された大腸菌の選別

寒天培地上には多くの大腸菌がいる。
その中から形質転換されたベクターのみを選ぶ必要がある。
そこで、ベクター内に抗生物質耐性遺伝子をいれておく。

寒天培地に抗生物質を撒いておくと、ベクターを持たない大腸菌は抗生物質によって死滅する。
しかし、ベクターを持つ大腸菌は耐性遺伝子を持っているため、生き延びる事ができる。

よって、この寒天培地上でコロニーを形成した大腸菌は形質転換されたものであると判断することができる。

しかし、培養から時間が経ってしまうと、抗生物質の効果が薄れてくる。
そうするとベクターを持たない大腸菌も生き延びる事ができてしまう。

このベクターを持たない大腸菌のコロニーを「サテライトコロニー」とよぶ。

選別した大腸菌の培養・精製

コロニーを抗生物質入りの液体培地で培養する。
抗生物質のおかげで、ベクターを持った大腸菌のみが増殖することができる。

ある程度増殖したら、大腸菌を集めて破砕・精製を行えば、無事DNAを獲得できる。
(この段階ざっくりですいません。別記事にてまとめたいと思います)

最後に

今回はほしいDNAを得るまでの流れをまとめた。

こうして書くと遺伝子組換えは簡単な技術に見えるが、やはりそこは生物(なまもの)である。
それぞれのステップには実験を成功させるために、気をつけるべきポイントがある。
原理を理解し、実験操作の意味を理解することが重要である。

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