タンパク質を宿主から安定的に取り出すために

培養した微生物を運ぶ人 タンパク質精製

分子クローニングや遺伝子工学が発展し、研究者は微生物を用いて欲しいタンパク質を大量に作らせることができるようになった。

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微生物内で産生したタンパク質を取り出したいと考えたとする。
もちろん微生物は生きるために、多種多様なタンパク質を発現させている。

その中から、自分のほしいタンパク質のみを取り出さなければならない。
そのためのステップが「精製」である。

第一歩は、培養した微生物を破砕し、タンパク質を溶液として細胞外に取り出す。
タンパク質は非常に微妙なバランスで構造を保っているため、様々な理由で壊れてしまう。

そうならないために注意すべき事項として5点挙げる。

  1. pH
  2. 温度
  3. 分解酵素
  4. 表面変性
  5. 長期保存

タンパク質を安定に保つために

前提として、微生物内の環境と精製タンパク質の環境は異なる。
そのため、なるべく微生物内の環境に近くなるよう配慮する必要がある。
条件はタンパク質による部分があるのが正直なところですが、以下の5点は注意が必要となる。

pH

pHが変わると表面の電荷が変わり、タンパク質内や溶媒との相互作用が変わる。
外部環境の変化による変性を防ぐために、pHが一定となるような緩衝液(バッファー)に溶かす。

バッファーの種類によって得意とするpH領域がある。
目的のpHに合ったバッファーを使うのが重要となる。

参考URL: バッファーの種類が表としてまとめられている。

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温度

タンパク質は温度が上がると、変性する可能性が高くなる。
よほど頑丈なものでない限り、細胞破砕後は常に氷上に置くのが無難である。
これは3.で示す分解酵素の活性を抑える、という意味でも有効となる。

3. 分解酵素の存在

宿主の組織を壊すことによって、本来は膜で仕切られている生体分子も一緒に溶け出てくる。
その中でも注意すべきなのが、タンパク質分解酵素(プロテアーゼ)である。

宿主を破砕するときには

  • 目的タンパク質に影響を与えず
  • プロテアーゼの活性を抑えるよう配慮する

必要がある。

方法として、pHや温度の調整、あるいは分解酵素の活性阻害剤を加えるといった方法がある。
分解酵素の活性阻害剤は様々な試薬会社から市販されている。

参考URL:例えば、ロシュ社

https://roche-biochem.jp/catalog/category_33111

表面変性

タンパク質は非常にデリケートである。
タンパク質溶液を泡立てただけでも変性する恐れがある。

また、あまり気にしないかもしれないが、タンパク質溶液を入れるチューブ(プラスチック)の壁に接するだけで、ある程度のタンパク質は変性している。

影響が顕著な場合は低吸着チューブを使う手もある。

参考URL:

Protein LoBind Tubes - 実験用消耗品, 新製品 | チューブ, 実験用消耗品 - Eppendorf

長期保存

タンパク質は基本的に長期保存ができない。

空気中の酸素による酸化、微生物の混入などによって変性していく。

長期保存による変性を防ぐために

  • 窒素やアルゴンガスで置換する(酸化の原因の酸素を減らす)
  • -80℃、-196℃(液体窒素)で保存する

といった対策が取られる。

こうした対策をとっても、実験時にタンパク質構造を100%保っているという保証ができない。
実験計画(微生物の培養からタンパク質精製まで)はよく考えて立てる必要がある。

最後に:タンパク質の取扱いは難しい?

これを見て「タンパク質精製は難しそう」と感じるかもしれない。
しかし、研究室には長年のノウハウが蓄積され、精製条件が確立されているものである。
なので、最初から怖がる必要は無いだろう。

新しいタンパク質の精製を行う場合は、まずは元々の条件を試してみる。
うまく行かなかった場合、上記を参考に検討してみてほしい。

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