2019年ノーベル生理学賞・医学賞-低酸素応答に関する分子機構の解明

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すっかり世間はラグビーW杯一色ですので、とうに昔の話になってしまったかもしれませんが、ノーベル賞の話です。

少しずつ書いていたのですが、ここに来てようやっとまとまってきました。

今年のノーベル生理学賞・医学賞の受賞者は

  • Gregg Semenza 教授 (米国ジョン・ホプキンス大学)
  • William Kaelin 教授 (米国ハーバード大学)
  • Sir Peter Ratcliffe 教授 (英国オックスフォード大学)

の3名に決定しました。

受賞理由としては「低酸素応答因子の同定、および低酸素応答に関する分子機構の解明」となります。

以前にツイートしたように、内容について興味があったので、低酸素応答に関して明らかになっていった歴史についてまとめてみました。

とても「簡単に」とは言えない内容で、長くなってしまったのですが、興味のある部分だけでも見ていただければ幸いです。

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酸素の重要性

酸素が重要な分子であることに異議はないでしょう。では酸素は我々の体の中で何をしているのでしょう。

それはミトコンドリアで酸素を用いていわゆるエネルギー通貨として知られるアデノシン三リン酸(ATP)の産生です。

酸素を用いた好気呼吸によるATP産生は解糖系に比べて効率がよく、複雑な生体反応を行っていくために重要です。そのため、人は絶えず大気から酸素を取り入れて生きています。

酸素濃度の変化に対する応答

もう少しミクロなレベルで考えてみます。

体の中の臓器あるいは細胞レベルでも、どの部位でも酸素が必要であることには変わりありません。しかし、必要な酸素濃度というのは異なっているようです。代謝の速度に依存して変わるものと思われます。

また、周囲の環境によっても変わります。よく言われるのが高地にいるときです。
高地では酸素濃度が薄いので、地上と同じような呼吸では、取り入れられる酸素の量が少なくなってしまいます。

普段の生活でも、静止時と運動時ではエネルギーの消費量が違うので、必要となる酸素濃度というのも異なってきます。

よって多細胞生物は酸素レベルの変化に常に適応し、生体を適応させる必要があることがわかります。

低酸素状態になると、腎臓ではエリスロポエチン(Erythropoietin:EPO)というホルモンが分泌されます。EPOは造血幹細胞を刺激して、赤血球を増やす造血を促進します。

造血することにより、血中を運ぶことのできる酸素が増えて、全身により多くの酸素を運ぶことができるようになります。

では、体の中で臓器あるいは細胞は「低酸素状態である」ということをどのように感知しているのでしょうか?
そこが今回のノーベル賞受賞のきっかけとなる研究につながっていきます。

低酸素応答因子(HIF)の発見

上にも書いたように、低酸素状態になるとEPOが分泌され、造血が促進されます。ではどうやって酸素濃度を感知して、EPOを誘導するのかというそのメカニズムというのが気になります。

Gregg Semenza教授は1991年に発表した論文によって、EPOの遺伝子の3’末端にはいくつかの因子が結合するが、そのうち2つについて貧血状態になると肝臓や腎臓で誘導されることを示しました。

また、この領域がHypoxia-inducible enhancer(低酸素誘導型エンハンサー)として機能することもin vitroでの一過性発現を用いたアッセイ系によって明らかとしました

Semenza教授はこのエンハンサー領域をHypoxia response element (HRE)と名付けています。

ほぼ同時期にPeter Ratcliffe教授のラボでも肝細胞を用いた実験から、酸素レベルに応答するEPO遺伝子の3’末端のcis-acting DNA elementの存在を報告しました。

同一分子上の遺伝子発現を調節するDNAまたはRNAの領域のことを言います。遺伝子上の両端どちらかにある転写因子などが結合することのできる配列といえます。cisは「同じ側」という意味があります。

Semenza教授の見つけた2つの因子のうち、1つは恒常的に発現していますが、1つは低酸素状況に応じて誘導されることが明らかとなりました。

これが後の1992年のMol Cell Biolの論文(*)で肝がん細胞株Hep3Bから発見されたhypoxia-inducible factor(HIF)と名付けられる因子となります。
(*) G. L. Semenza, G. L. Wang, A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol. Cell. Biol. 12, 5447–5454 (1992).

その後、Ratcliffe教授とSemenza教授はEPOの3’末端のエンハンサー領域は多くの哺乳類細胞で低酸素に応答して誘導されるレポーターとして機能することを明らかにしました。

腎臓や肝臓で調べられていたことが他の細胞でも見られることから、HIFによる酸素感知機構というのが造血だけでなく普遍的に見られる機構である可能性が浮上し、この発見は多くの研究者の目を引きました。

1995年にはアミノ酸配列のシーケンシングとcDNAのクローニングに成功し、HIFがヘテロダイマーを形成していることを突き止めました。

ヘテロダイマーを構成するのは酸素に応答するHIF-1αと酸素に応答しないHIF-1βと明らかにしました。もっともHIF-1βに関してはすでにクローニングされていたARNTという遺伝子と同一でした。

カロリンスカ研究所のプレスリリースでもARNTという名前が使われているため、以後ARNTと呼称します。

ARNTは色々な因子とヘテロダイマーを構成するタンパク質であり、酸素に対する応答性もないことから必然的に低酸素応答において重要なのはHIF-1αということになります。

HIFファミリーの拡大

1997年に4つのグループがそれぞれほぼ同時期にHIF-1αに非常によく似たタンパク質があることを報告しました。

HIF-2αなどいろんな名前がつきましたが、最終的にはEPAS1という名前で呼ばれているようです(ここでも以後EPAS1とよびます)。

EPAS1はHIF-1αと非常に高い相同性を持っており、ARNTとヘテロダイマーも形成します。また、HIF-1αと同様に低酸素応答も示し、HIF-1αと同じ制御モチーフもすべて持っています。

しかし、HIF-1αとHIF-2α(EPAS1)には決定的な違いがあります。HIF-1αの欠損マウスは胎生致死であることが報告されています。一方でEPAS1は異なる表現型を示します。

加えて、いくつかの低酸素応答に関しては、他の酸素感受的なHIFの相同体がもっぱら制御しているという証拠も多く見つかっています。たとえば、血管新生ではEPAS1がメインの制御因子として機能しているようです。

HIFの翻訳後制御とVHLの関与

低酸素状態のときに活躍する因子としてHIFがあるということはわかりましたが、まだ”What”の部分がわかっただけです。低酸素状態に対する応答機構、つまり”How”に関することに関しては全く出てきていません。”How”が次の焦点となります。

ここで重要になるのが、受賞者3人のうちの最後の1人William Kaelin教授の研究です。新しい因子が出てきて少し話が変わる印象を受けるかもしれませんが、後でしっかりとつながってきます。

1995年、Kaelin教授のグループはがん抑制遺伝子として知られていたVHLの全長配列を報告しました。また、Renal carcinoma cell(腎臓がん細胞)にWTのVHLを再導入すると、腫瘍の形成を阻害することも示しています。

それから多くのグループがVHL遺伝子について研究し、がんに対する遺伝的傾向と家族性の関連性について明らかにしようとしました。

Kaelin教授のグループはVHLはがん抑制遺伝子であり、VHLに変異を持つ患者由来の細胞において腫瘍の成長を阻害する働きがあることを示しました。

1996年にはVHL遺伝子の機能解明を行っている過程で、Mark Goldberg氏がVHL変異細胞株では多くのHIFの標的遺伝子が過剰発現していることを見出しました。

この発見が、HIFの応答とVHLを介した腫瘍形成は何らかの形でつながっているのではないかという仮説が立てられました。

ここでVHLの機能に関して重要な手がかりとなると考えられていたのが、結合パートナーとなるタンパク質の同定です。

Richard Klauser教授とその同僚はKaelin教授らのグループと同様に、1995年にVHLが転写伸長因子elonginBおよびCと相互作用することを見出しました。

さらに1997年にはKlauser教授、W. Marston教授らによってVHLタンパク質はCul-2と相互作用するということも明らかにしました。

このCul-2は何かというとタンパク質のユビキチン化に関与しているタンパク質です。elonginCとCul-2がユビキチン依存性のタンパク質分解において標的タンパク質と相互作用するE3として知られるSkp1とCdc53と相同性を持っています。

ユビキチンとは?

タンパク質分解の目印となる76残基の小さなタンパク質です。ユビキチンはE1とよばれるタンパク質からE2へと受け渡されます。E3はE2および分解したいタンパク質と三者で相互作用してE2から標的のタンパク質へのユビキチンの受け渡しを補助する機能があります。

そのことから、VHLとユビキチン依存的なタンパク質の分解に関わっているのではないかということが示唆されました。

HIFとVHLの関与による調節機構

その後1998年頃までの研究によって、HIF-1αとEPAS1は通常の酸素条件下ではプロテアソームによるタンパク質分解によって除去されるということが明らかとなりました。

1999年にはPeter Ratcliffe教授がVHL複合体がHIF-1αのタンパク質分解に関与していることを示す論文を発表しました。後の2000年にはVHLがE3の構成因子であるということを示しています。

上述のユビキチンが付加されたタンパク質はプロテアソームというタンパク質によって分解されます。

ここで次の問題は、ユビキチン依存的なタンパク質分解が低酸素条件でどうやって止まるのか?という点です。

先程も述べたようにHIFの量というのは遺伝子発現の段階ではなく、翻訳後のタンパク質の段階で行われます。発現したHIFがプロテアソームで分解されてしまっては元も子もありません。

そこには何かまだ足りないピースがありそうです。

そのヒントとなりそうな指摘が1999年のMaxwell教授の論文によってなされました。VHL-HIF1α相互作用が酸素と鉄に依存しているということです。

我々と同様、細胞にとっても酸素というのは目に見えない(はず)です。そんな目に見えない酸素を感知するために、どういう方策を取るといいでしょう?
1つは酸素を利用する反応が進行するかどうかによって判断します。反応が進行すれば酸素がある証拠になりますし、逆もまた然りです。

つまり酸素と鉄を使った反応が起こるかどうかで酸素濃度を感知している可能性が浮上したのです。

ちょうど時を同じくして、酸素依存的にヒドロキシル化(-OH)がコラーゲンに対して起こるということが知られるようになってきました。この反応にはコラーゲンプロリル4-ヒドロキシラーゼ(prolyl-4-hydroxylase)が関わっています。そのまんまですね。

プロリルヒドロキシラーゼは以下の反応を触媒します。

この知見にインスパイアされたのかどうかはわかりませんが、2001年にRatcliffe教授とKaelin教授はほぼ同時にHIF1α中の2つのプロリン残基が酸素依存的に4-ヒドロキシル化することによってVHL複合体との親和性が上昇するということを示しました。

つまりプロリン残基のヒドロキシル化に酸素が必要であることを利用して、ヒドロキシル化の反応の進行を低酸素応答の指標にしていたということです。

酸素依存的なHIFとVHLの相互作用のスイッチとなるものとは?

では、HIF-1αのプロリン残基をヒドロキシル化する因子を探そうという流れになります。

Ratcliffe教授のグループとMcKnight教授のグループは、それぞれ2001年にHIF1αとEPAS1のヒドロキシル化に関与するプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)遺伝子を同定したと発表しました。

Kaelin教授のグループもPHD遺伝子を生化学的な手法を用いて同定した論文を2002年に発表しています。

これで低酸素応答に関わるピースが揃いました。ヒドロキシラーゼが同定されたことである仮説が提唱されました。

特異的なPHD阻害剤を開発することができれば、HIF活性を人工的に上昇させることができ、貧血患者のEPOを増加する(=貧血の治療につながる)ことができるのではないか?ということです。

以下でも少し触れますが、そのような方向性で研究しているグループもあるようです。

このメカニズムの発見の意義

ここまでわかってきたことを簡単にまとめると以下のようになります。

酸素が十分に存在すると、PHDによるHIF-1αのプロリン残基がヒドロキシル化され、VHLによって認識され、プロテアソーム系による分解へと誘導されます。

逆に酸素が不足すると、HIF-1αのヒドロキシル化は起きず、VHL複合体はHIF-1αを認識することができません。すると、プロテアソームによる分解を免れてタンパク質は無傷の状態で存在することができます。こうしてHIF-1αは本来の機能を発揮し、低酸素誘導因子(HRE)に結合することでの標的遺伝子の発現を活性化させることができます。

プロリルヒドロキシラーゼの発見はヒドロキシラーゼの阻害剤の探索という新たな薬剤ターゲットの道を開きました。

実際にPHD酵素を阻害することによってHIFの機能を向上させうる薬剤が多く臨床段階に入っており、近年の論文では貧血の治療に効果が出たといったような報告もなされています。

HIF経路の阻害に対する将来的な応用もすぐそこまで来ているようです。1つはVHLの変異を誘発することによってあるガンの進行を遅らせる事のできる薬剤の開発です。

そのうちの1つがEPAS1の機能の特異的阻害剤であり、それらは近年Kaelin教授のグループが動物モデルを用いた研究でVHL変異細胞の腫瘍成長が鈍化したことを示しました。

最後に-低酸素応答因子の分子機構解明の将来展望

HIFの機能として免疫機能、軟骨形成、傷病治癒と広範な現象に関わっていることから、薬理学的にHIFの機能を向上させることは多くの疾患を治療しうると考えられています。

反対に、HIFの機能を阻害する方にも多くの応用が考えられます。HIFの発現量上昇は卒中、心疾患、肺高血圧症を含むいくつかの循環器系の疾患と同様に多くのがんで見られるそうです。

このことから、今回のノーベル賞を勝ち取った発見であったとしてもその応用に関してはまだ入口に立ったに過ぎないのでしょう。まだまだ研究は発展途上ですし、これからという部分も多いと感じます。

かなりのボリュームですし、色々わかりにくいところもあったかもしれませんが、このボリュームを最後まで読んでくださった方は、感謝いたします。

もう少し展望的なところもあったり、個人的にこうつながったら面白いかもなーと思うところもあるので、また機を見て書いてみたいと思います。

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